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1.方法
    (1)本实验将C6细胞分成Q0、Q50、Q100和Q1504个组,Q0组加适量二甲亚砜(DMSO,即槲皮素溶剂,每2mlDMEM全培养基中加1μl二甲亚砜,低浓度DMSO对细胞生长等无影响)处理,Q50、Q100和Q150槲皮素的浓度分别为50、100、150μmol/L。然后将其放入37℃、5%的CO2孵箱中进行培养。
    (2)将三维细胞培养基质胶Matrigel置冰上或放于冰箱内2~8℃过夜解冻,吸管轻轻吹打,避免吸入气泡。将用高糖DMEM做1∶5稀释后的Matrigel涂于Insert细胞生长面,150~200μl/cm2,37℃作用30min,备用。将饥饿12~24h后的C6细胞制备细胞悬液,离心弃培养液,PBS洗1~2遍,用含0.1%FBS的DMEM配养基重悬细胞,将细胞密度调至于5×105个/厘米2。取200μl细胞悬液加入Transwell上室,取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μl加入下室。37℃、5%的CO2培养36h后,用棉签擦去Matrigel和上室内细胞,甲醛固定10min。0.1%结晶紫室温下孵育10min,清水漂洗3遍以上。将Transwell小室翻过来底面朝上置显微镜下观察拍照,随机选取8~10个视野进行计数。
    (3)将饥饿12~24h后的C6细胞制备细胞悬液,离心弃培养液,PBS洗1~2遍,用含0.1%FBS的DMEM配养基重悬细胞,将细胞密度调至于5×105个/厘米2。取200μl细胞悬液加入Transwell上室,取含10%FBS的高糖DMEM培养基500μl加入下室。37℃、5%的CO2培养36h后,用棉签擦去上室内细胞,甲醛固定10min。0.1%结晶紫室温孵育10min,清水漂洗3遍以上。将Transwell小室翻过来底面朝上置显微镜下观察拍照,随机选取8~10个视野进行计数。
    (4)将培养好的C6胶质瘤的细胞培养基半量换液,加入1ml含20μmol/LEdU的全培养基,其最终工作浓度为10μmol/L。将其置于37℃,5%CO2的培养箱中培养24h后弃去培养液,加入1ml3.7%甲醛室温下固定15min,弃去固定液,用3%BSA洗两遍。然后再加入1ml0.5%TritonX-100室温下孵育20min;弃去通透液,用3%BSA洗两遍。然后加入0.5mlClick-iT反应混合液,室温下避光振荡30min。弃去反应液,用3%BSA洗1遍。然后再加入1ml1×Hoechst33342反应液室温下避光反应30min。用PBS清洗两遍后,将其置于激光共聚焦显微镜下拍照分析并计算其增殖细胞百分比。
    (5)将收集的悬浮细胞室温下400g离心5min。弃上清,加入250μl胰酶溶液(A液),用手指轻弹将其混匀,室温下反应10min。然后再加入200μl的胰酶抑制剂和核糖核酸酶的混合液(B液),用手指轻弹将其混匀,室温下反应10min。最后加入200μl冰冷的PI染液(C液)用手指轻弹将其混匀,4℃避光反应10min。然后将其在3h内上流式细胞仪检测。

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